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所有先前描述的活動對于設計一種實驗測試都是有用的，該實驗測試能夠在行為任務期間無創地估計自由運動的綿羊的腦血流動力學。選擇運動任務和令人震驚的測試作為選舉評估，因為（a）我們想要一個簡單的測試（運動任務）作為我們方法方法的驗證；（b）這項驚人的測試可以讓我們深入了解監測綿羊情緒和認知反應的可能性。
在fNIRS記錄之前，綿羊接受了一段訓練期，以盡量減少可能與任務績效和行為反應相關的壓力，這些可能會影響fNIRS數據采集的質量39。特別是，這些羊習慣于被分成同一群的小動物，由人類處理，并佩戴假fNIRS裝置（包括帽子、電纜和胸帶）。然后，他們接受訓練，根據聲音提示行走和停止。
運動任務的結果令人鼓舞，因為觀察到了典型的血流動力學反應，位于fNIRS探針正下方的皮層中O2Hb增加，HHb減少，而非神經組織（包括皮膚、皮下層、骨骼和硬腦膜）沒有明顯的貢獻。根據對人類受試者進行的fNIRS實驗結果，其中發現運動任務和行走實驗的血流動力學反應相似40，41，我們可以得出結論，具有所建議設置的fNISS技術能夠監測與綿羊執行運動任務相關的皮質反應。
在令人吃驚的測試中，我們發現，當在令人震驚的刺激（飛行反應）過程中移動時，綿羊在實際刺激后表現出短暫的大腦激活（即血流動力學反應增強）。然而，當綿羊處于冰凍狀態，因此在驚嚇刺激后保持靜止時，兩個半球的反應都很小，只顯示出[O2Hb]的有限下降。盡管表現出凍結反應的羊塊數量有限，但這些結果表明，驚嚇刺激后觀察到的大腦反應很可能來自運動，而不是驚嚇本身，如圖3和圖4所示。
這些結果得益于對大腦外和大腦組織層的同時研究，這有助于識別發生時的經典神經激活。
本研究中獲得的綿羊神經成像數據（見補充章節S1）表明，在我們的實驗設置中，fNIRS傳感器位于綿羊運動皮層上方，并記錄了與布羅德曼4區相關的血管動力學（關于綿羊運動皮層位置和連接的擴展討論和參考，參見參考文獻42），這項令人震驚的測試和運動任務的結果進一步表明，我們主要是在測量綿羊大腦的運動區域，而不是探測位于太深位置的眶上回“前額葉”皮層或與情緒處理相關的其他皮層區域。事實上，DTI MRI數據還證實，源自fNIRS探針下皮質區域的纖維束屬于錐體和錐體外運動控制通路，它們投射到腦干中運動方案的發生器或脊髓，無論是同側還是（大部分）相反側42）。
受動物頭部尺寸的限制，fNIRS探頭的定位以及fNIRS裝置的基本特性（例如波長范圍、光功率）與先前發表的工作23、26、27、28相似。與其他研究不同，由于使用了適當的短距離和長距離通道，我們能夠清楚地區分大腦外組織和大腦組織的貢獻。我們的經驗表明，文獻6、30中報道的動物情緒和認知反應的fNIRS結果不一致且相互沖突，這可以通過這樣一個事實來解釋，即光子不太可能到達綿羊相當于人類前額葉皮層和其他專門處理認知刺激的區域，以及動物顱骨中緊接在其下方的呼吸竇（參見補充部分S1和補充部分S3）。
盡管我們仔細評估了先前實驗工作的所有潛在混雜因素，但我們也意識到，仍存在一些可能影響本研究結果的局限性。
fNIRS探針位置的選擇取決于綿羊頭部的解剖結構。頭骨的自然彎曲使得傳感器只能定位在頭部的頂部，并防止使用更大的源探測器距離（ρ > 30毫米）。此外，更短的源探測器距離（ρ < 10mm）可能有助于更好地辨別額外-此外，更短的源探測器距離（ρ < 10mm）可能有助于更好地區分腦外和腦內層，但在我們的工作中，fNIRS傳感器的特定配置阻止了這一點。
我們只有有限數量的fNIRS傳感器，無法以更好的橫向分辨率繪制血流動力學響應圖，例如區分大腦皮層的前部和后部。如果一個人有興趣了解特定的機制和參與運動執行的所有不同的皮質區域，那么標測是很重要的。事實上，運動是一項涉及大腦多個區域的復雜任務43；關于大型食草動物運動皮層組織的綜述和擴展參考文獻，參見參考文獻44。因此，在我們的工作中，當羊在運動時，大腦中的具體工作機制和多個大腦區域的反應尚無法詳細研究，需要進一步研究。
我們通過使用均勻模型測量了綿羊頭部的基線光學特性。我們使用的時間分辨漫反射光譜系統具有有限的響應性，這阻止了在足夠短的總采集時間內采集多個離散波長的多距離測量值（正確應用兩層模型所需），從而不會在被測動物中引起應力。改進基線光學特性的估計可以進一步改善血流動力學反應的量化。
同樣，假設減少的散射系數在時間（實驗期間）和空間（腦外和腦內體層）上是恒定的，可能會影響血流動力學響應的準確性。然而，在功能測試期間，減小的散射系數不太可能發生明顯變化。
我們忽略了其他發色團（如水、脂質、拼貼）在估算（基線和瞬時）O2Hb和HHb濃度中的貢獻。與減小的散射系數一樣，我們不期望這些參數在功能測試期間發生顯著變化。
在預處理階段，基于對視頻記錄的視覺檢查來去除塊。去除偽影，特別是運動偽影的另一種更客觀的方法是使用加速度計25。由于所使用的fNIRS設備沒有內置加速度傳感器，我們傾向于不在動物頭部的有限空間上添加另一個傳感器，從而使實驗設置更加復雜。
最后，目前的工作并沒有給出關于綿羊進行行為任務的大腦反應模式的明確結論。事實上，從一個或幾個實驗中很難獲得清晰明確的大腦反應模式，這些實驗需要重復試驗或更大的動物樣本。fNIRS技術仍然是研究自由活動動物皮層活動的創新方法，使用fNIRS對動物進行的研究數量仍然很少。
方法
道德聲明
所有動物實驗方法均按照相關指南和法規進行，所有實驗方案均由指定的機構和/或許可委員會批準。特別是，該研究設計符合意大利動物實驗立法，并獲得了國家倫理委員會的批準（Ministero della Salute，Direzone Generale della SanitàAnimale e dei Farmaci Veterinari，Uffio 6，授權編號：◦457/2016-PR，919/2017-PR）。如果任何動物被認為處于輕度以上的壓力（由獨立獸醫現場評估），那么它將立即從研究中移除。
動物、住房和畜牧業
13只8個月大的薩爾達羊從同一群中選出。所有的綿羊都沒有懷孕或哺乳期，它們以前從未參與過任何研究。他們被安置在一個45平方米的圍欄（休息箱）中，每天喂兩次干草（上午8點和下午6點）。飲食中補充了商業濃縮物（Mangimi Ariston Srl，Teramo，意大利；250–300克/只羊）。所有的羊都可以自由飲水，并提供稻草作為被褥。
實驗區域和行為任務
為了測量不同條件下的大腦活動，所有綿羊都進行了一項運動任務和一項令人吃驚的測試。實驗區（圖5）是綿羊熟悉的，它包括一條走廊（2米寬 × 20m長）和驚嚇測試筆。走廊末端用通常用于建造動物圍欄的金屬板封閉（高度1.5米）。驚嚇測試圍欄與綿羊飼養時的圍欄相似。為了避免在行為任務中與羊群隔離的任何負面影響，綿羊總是被分成小組飼養（3-5名受試者）。
圖5
圖5
實驗區域（a）的示意圖，虛線表示移動圍欄，白線表示運動任務包括綿羊以相同的速度沿著走廊行走，并在被要求時停下。因此，每次都有五只羊在走廊里移動，并訓練它們在30秒內緩慢而平靜地行走，然后在接下來的30秒內停止行走。為此，它們通過經典的條件調節訓練，根據聲音提示開始和停止行走。培訓每天進行，為期26天。我們逐漸習慣于讓羊戴上假fNIRS探頭，包括帽子、電纜和胸帶，遵循以下方案：第1天到第7天，羊在沒有任何探頭的情況下行走；第8-14天，綿羊戴著探頭的支撐面罩行走；第15-26天，綿羊戴著探針的支撐面罩和模擬探針壓力的海綿行走。在訓練階段結束時，綿羊沒有表現出壓力的跡象。
令人震驚的測試是，在動物附近突然打開一把傘，能夠引起恐懼反應。為了減少習慣對驚人刺激的影響，選擇進行fNIRS測量的綿羊之前從未接觸過這種刺激。
fNIRS數據記錄和數據分析
為了準確測量每只綿羊在進行不同行為任務時氧合血紅蛋白（[ΔO2Hb]）和脫氧血紅蛋白（[△HHb]）的濃度變化，可穿戴CW fNIRS系統（OctaMon，Artinis Medical Systems，The Netherlands）在兩個波長（751 nm和839 nm）下以10 Hz的采樣率運行，并且配備有4個發射器（光源）和2個接收器（檢測器）。該設備由制造商定制，以實現多距離采集。兩個光源和一個探測器放置在每個半球上，距離ρ = 10 mm和ρ = 分別為30mm，如圖6a所示。這種配置允許記錄來自淺表組織（例如頭皮和顱骨）和皮質組織的信號。在fNIRS記錄過程中，將傳感器應用于剃光的羊頭上，并用定制的頭帽固定到位，如圖所示。6b。
圖6
圖6
（a） 羊頭表面光學探頭的配置：紅星代表發射器，綠色圓圈代表接收器。（b） 配有fNIRS裝置的綿羊。
全尺寸圖像
所有綿羊的fNIRS記錄在連續兩天內完成（第一天運動任務，第二天驚人測試）。在運動任務中，我們為每只羊記錄了10次重復（塊），每次重復30秒的步行，然后休息30秒（動物靜止）。對于這項令人吃驚的測試，我們為每只羊記錄了5個區塊，包括30秒的基線（羊靜止），接著是雨傘打開（3秒），然后是60秒的恐懼反應。運動任務和驚人測試的所有環節都用攝像機（松下，HDC-SD99，松下，日本）拍攝，并與fNIRS記錄同步。然后使用軟件Solomon Coder（beta 11.01版）分析視頻記錄。22），以確定綿羊是否表現出可能干擾fNIRS記錄的行為，例如搖頭、奔跑和跳躍。對于驚嚇測試，評估恐懼反應（刺激后是否有飛行和/或凍結反應）。所考慮行為的行為圖見補充表ST2。
fNIRS數據通過Matlab2015a中的腳本進行分析（Matlab，The MathWorks Inc.，Natick，Massachusetts）。由Oxysoft軟件（v3.0.95，Artinis Medical Systems，荷蘭）提取的原始fNIRS數據是每個波長和每個通道的光密度（OD）。對于每個任務，選擇每個塊之前的最后5秒作為基線。然后通過從所有OD值中減去基線時期的平均OD來計算OD相對于基線的變化（即ΔOD）。
根據對同齡羊的解剖和MRI測量，頭皮和大腦皮層之間的平均距離估計為 = 10 mm。鑒于此，我們假設（見補充章節S3）ρ的ΔOD數據 = 10mm（ΔODSHORT）是指僅在腦外組織（頭皮、顱骨和腦脊液）中傳播的光子。因此，使用Levenberg–Marquardt算法進行非線性迭代最小二乘最小化（Matlab中的lsqcurvefit函數），并假設上層（代表腦外組織）的減少散射系數等于基線值（μs′UP = μs0′），我們將ΔODSHORT數據擬合到同質模型45，以估計相對于上層基線的吸收變化（ΔμaUP）。然后將上層吸收系數的絕對值計算為μaUP = μa0 + ΔμaUP，通過將基線吸收系數μa0與ΔμaUP相加（關于μa0估計值的描述，請參見補充章節S2）。
接下來，我們使用ρ處記錄的ΔOD = 30 mm（ΔODLONG）和光子遷移的兩層模型46，以導出Δμ接下來，我們使用ρ處記錄的ΔOD = 30 mm（ΔODLONG）和光子遷移的兩層模型46，以導出ΔμaDOWN，即底層（代表腦組織）吸收系數的變化。在此步驟中，我們假設上層的厚度為先驗信息 = 10mm）、上層的吸收系數（μaUP）和上層和底層的降低散射系數（μs′UP = μs向下 = μs0′）。然后將底層吸收系數的絕對值計算為μaDOWN = μa0 + Δμa下降。
最后，根據兩個波長的μaUP和μaDOWN，利用從成年綿羊47的測量得出的消光系數，通過比爾定律計算了兩個層中的[O2Hb]和[HB]：1.672 cm−1 mM−1（751 nm），0.824 cm−1 m M−2（839 nm），以及[O2Hb]:0.752 cm−1 mM M−1），1.084 cm−1 mmM−1。
結論
我們在這項研究中的目標是提高綿羊fNIRS測量的準確性和可靠性，以更好地理解在不同環境條件下無創評估自由活動動物大腦活動的潛力。我們的研究結果證實，多距離CW fNIRS可以無創地測量自由運動的綿羊大腦皮層的活動，并且使用短距離和長距離的源探測器，結合光子擴散的兩層模型，可以有效地區分大腦外信號和皮層信號�？偟膩碚f，這些結果表明，利用當前的設置和探頭放置，我們主要測量的是綿羊大腦的運動區域。需要進一步的研究來澄清fNIRS技術是否可以可靠地應用于測量參與處理情感狀態反應的深層皮質區域。未來的工作還必須考慮影響測量準確性的可能因素，例如探頭位置和與認知功能相對應的物種特定神經解剖位置。 |
