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fNIRS無創監測綿羊腦功能和情緒的可靠性
摘要
這項工作的目的是批判性地評估功能性近紅外光譜（fNIRS）是否可以作為無創記錄綿羊大腦功能和情緒的工具。我們考慮了一種實驗設計，包括儀器（定制的無線多距離fNIRS系統）、更精確的物理建模（光子擴散的兩層模型和3D蒙特卡羅模擬）、神經解剖工具的支持（通過相同動物的MRI和DTI數據定位fNIRS探針）、，以及測試自由運動綿羊行為反應的嚴格協議（運動任務、驚人測試）。在運動任務和驚人測試中，幾乎沒有發現大腦外區域的血流動力學反應。在運動任務中，正如預期的那樣，我們發現綿羊行走時大腦區域出現了典型的血流動力學反應。在這項令人震驚的測試中，測得的大腦區域血流動力學反應主要來自運動�？偟膩碚f，這些結果表明，利用當前的設置和探針定位，我們主要是測量綿羊大腦的運動區域，而不是探測與情緒處理相關的太深的皮層區域。
介紹
對待動物的方式對動物和人都很重要。對動物福利的關注源于人們認識到動物是有知覺的生物，尋找動物情緒和認知過程的無創指標是從神經科學到動物福利等學科的一個重要目標。然而，家養食草動物行為的神經生理基礎，飼養用于肉類、牛奶或羊毛生產，在很大程度上仍然是未知的。綿羊可以作為一個有效的模型，用于執行各種復雜的任務和行為，包括目標導向的運動協調、情緒、面部識別和基于記憶的表現1、2、3、4。此外，在轉化實驗神經科學中，綿羊的回旋腦可以被視為嚙齒類動物的替代物1.5。由于認知過程或情緒狀態通�？梢苑从吃诖竽X反應6中，因此更好地理解綿羊在各種環境中的情緒狀態或對不同刺激的反應將有利于神經科學和動物福利。
了解動物大腦中的認知過程和情緒狀態是如何表達的仍然是一個挑戰，尤其是以非侵入性的方式。此前，已在動物大腦的功能成像中使用了幾種成功用于人腦標測的方法，包括功能磁共振成像（fMRI）7、8、9、10、11、12、13、14、腦電圖和感覺誘發電位15、16、17、18、19。雖然在人類研究中，任務和刺激可以呈現給清醒和協作的對象，但大多數測量技術要求動物處于麻醉狀態。因此，它的大腦反應會受到強烈影響。
功能近紅外光譜（fNIRS）是一種新的技術，它利用近紅外光非侵入性地測量人類大腦組織中氧合血紅蛋白[O2Hb]和脫氧血紅蛋白[HB]的濃度，或典型地測量它們相對于基線時期[ΔO2Hb]和[ΔHHb]的變化。與fMRI一樣，fNIRS依賴于神經血管耦合機制20，以及近紅外光深度穿透生物組織的能力21。fNIRS具有非侵入性、安全性、便攜性和對運動偽影的敏感性低的特點，已廣泛成功地應用于人類研究22。最常用的fNIRS方法是使用穩態光源和檢測器21的連續波fNIRS（CW fNIRS）。由于CW fNIRS系統可以無線和小型化，因此也在自由移動的家畜中進行了一些應用，例如山羊23、狗24和綿羊25、26、27、28、29。在這些研究中，fNIRS監測被認為是一種額外的技術，用于測量暴露于不同刺激或不同環境的動物的情緒和認知反應。值得注意的是，研究結果有時不一致，6，30，這表明需要提高測量精度和可靠性。
事實上，以前所有關于農場動物的研究23、24、25、26、27、28、29都采用了一種專為人類新生兒而設計的fNIRS系統，但未針對特定物種的動物分析學31進行優化。特別是，它們都使用了固定的源配置此外，與通常在人類fNIRS研究中所做的不同，在fNIRS中，探頭的放置可以通過適當的神經解剖圖像和功能圖譜33、34、35來指導，探頭在動物頭部的放置沒有磁共振成像（MRI）數據的幫助，而且很少有動物大腦的神經解剖或功能圖譜25的支持。因此，fNIRS信號被歸因于額葉或前額葉區域，也假設了大腦皮層中的血管盜竊機制23、26、27、28，但沒有確定該技術對特定皮層區域的敏感性。
此外，用于fNIRS數據分析的方法可能缺乏準確性。事實上，頭皮中發生的表面血流動力學事件可能會干擾皮層的血流動力學變化，除非采用適當的幾何方法來模擬動物頭部。
最后，fNIRS數據處理利用了從文獻中獲取的關于差分路徑長度因子（DPF）的先驗信息，并從單個死亡動物中獲得36。為了提高fNIRS數據分析的準確性，DPF實際上用于通過改進的比爾-朗伯定律或類似的基于模型的方法21從測量的強度變化中導出血紅蛋白變化。錯誤的DPF數據可能導致對血紅蛋白濃度的不準確估計。
從上述觀察結果可以看出，fNIRS技術仍然是一種創新的、未經充分驗證的方法，用于研究家畜的皮層活動。這項工作的目的是提高綿羊fNIRS測量的可靠性和準確性，并批判性地評估fNIRS是否可以作為無創記錄該物種大腦功能和情緒的工具。為此，我們考慮了一種實驗設計，該設計包括儀器（定制的無線多距離fNIRS系統）、更精確的物理建模（光子擴散的兩層模型和3D蒙特卡羅模擬）、神經解剖工具的支持（通過相同動物的MRI和DTI數據定位fNIRS探針）、，以及測試自由運動綿羊行為反應的嚴格協議（運動任務、驚人測試）。
后果
運動任務期間的血流動力學變化
在執行運動任務的13只綿羊中，有兩只綿羊因頻繁的頭部抖動而被排除在分析之外，如視頻記錄評估所示（有關行為圖的詳細信息，請參見補充表ST2）。在剩下的11只羊中，我們計算了左右半球的組平均值[ΔO2Hb]和[ΔHHb]（圖1，下排）。兩個半球的組平均值顯示了典型的血流動力學反應，在運動期間腦組織中[ΔO2Hb]增加，[ΔHHb]非對稱性降低（p < 0.005）。在腦外組織中幾乎沒有觀察到血流動力學變化（圖1頂行）。
圖1
圖1
[ΔO2Hb]（紅線）和[ΔHHb]（藍線）的組平均值，單位為μM，以及大腦外（上）組織（上排）和大腦（下）組織（下排）以及左（左列）和右（右列）半球在運動任務期間的標準差。在每個地塊中，前5秒是基線（綿羊靜止），隨后是30秒的步行（標記為灰色區域），最后是5秒的恢復期（綿羊靜止不動）。每個子圖形中的水平黑線表示零值。
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椋鳥試驗期間的血流動力學變化
13只羊接受了令人震驚的測試，其中3只羊由于在測試過程中的行為而被排除在外：兩只羊表現出頻繁的頭部抖動；其中一人在雨傘打開后沒有飛行反應或結冰。在剩下的10只羊中，如果動物在咀嚼或搖頭，我們也排除了阻塞。因此，我們保留了約80%的記錄塊（共39個），然后對其進行平均以獲得組平均值[ΔO2Hb]和[ΔHHb]。在整個測試過程中，大腦外組織幾乎沒有血流動力學變化，如圖2所示，頂行。在兩個半球中，在驚嚇刺激后，大腦組織顯示出[O2Hb]的短暫增加（如圖2，底部一行所示）。此外，右半球還顯示出一種短暫的經典大腦激活模式，[O2Hb]增加，[HB]減少。
圖2:
圖2:
[ΔO2Hb]（紅線）和[ΔHHb]（藍線）的組平均值（單位：μM），以及在大腦外（上）組織（上排）和大腦（下）組織（下排）以及左（左列）和右（右列）半球的驚人測試中的標準差。在每個子圖中，前5秒是基線，隨后是3秒的驚嚇刺激（標記為灰色區域），最后是60秒的恐懼反應。每個子圖中的水平黑線表示零值。
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對動物行為的分析揭示了對驚嚇刺激的兩種不同反應：在10只羊的28個街區中觀察到飛行反應，而在8只羊的11個街區中觀測到冰凍反應。因此，我們計算了兩組（標記為移動組和站立組）的組平均值[ΔO2Hb]和[ΔHHb]。
兩組大腦外組織幾乎沒有血流動力學反應（圖3頂行，圖4頂行）。在腦組織中，對于Move組（圖3底部一行），我們在左半球和右半球都有典型的血流動力學反應（即[O2Hb]增加和[HHb]減少）。我們還注意到，在典型反應之前，在傘打開期間，左半球大腦組織中的氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白都增加了（見圖3底部行中的灰色區域）。
圖3
圖3
與圖2相同，但移動組的組平均值（綿羊在3秒的驚人刺激期間和之后移動）。
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圖4
圖4
與圖2相同，但站立組的組平均值（綿羊在3秒的驚人刺激期間和之后仍在）。
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相反，對于Stand組，兩個半球的血流動力學變化模式不太清楚且不同。在左半球，我們看到[O2Hb]和[HHb]快速增加，隨后[O2Hb]緩慢衰減到小于基線的值，而對于[HHb]，我們觀察到返回到基線值，有一個小的下沖（見圖4，左下圖）。在【O2Hb】和【HHb】初始下降后的右半球，我們注意到【HHb’回歸基線，【O2Hb】出現不規則振蕩，導致值低于基線（見圖4，右下面板）。
討論
這項研究通過使用可穿戴的CW fNIRS系統研究了自由運動的綿羊的大腦活動，該系統應用于執行運動任務的動物，并進行了驚人的測試。在這里，我們描述了一種實驗設計，其中包括儀器的進步、更精確的物理建模和評估動物行為反應的嚴格協議，目的是改進應用于家畜的fNIRS方法。
首先，我們采用了定制的多距離無線CW fNIRS系統，該系統具有可自由調整的源和檢測器位置。使用的短和長源探測器距離為ρ = 10 mm和ρ = 分別為30mm。盡管受動物頭部的大小和解剖特征的限制，但這種配置既允許由于長距離（比之前的研究更長）而增強羊頭部的光子穿透深度，也允許由于短距離的減少而更好地區分大腦外和大腦內的貢獻。ρ處光子穿透深度的研究 = 10 mm和ρ = 在補充部分S3中報告了簡化（均質板）和真實（MRI數據的3D網格）幾何形狀中的30mm，以幫助讀者了解不同距離處光子穿透的不同特征。
我們隨后通過相同動物的MRI數據指導fNIRS探針的定位，因為沒有薩達羊的神經解剖和功能圖譜（本研究中使用）。我們還通過動物大腦的擴散張量成像（DTI）MRI檢查了信號的功能來源。根據MRI和DTI數據，我們確認fNIRS探針的位置位于皮層的運動區域上方（見補充章節S1）。
此外，我們通過采用最先進的多波長時間分辨漫反射光譜系統，無創地測量了所有動物頭部的光學特性（吸收系數和降低的散射系數）（見補充部分S2）。在幾個波長下獲取了飛行時間（DTOF）的光子分布，并將其擬合到光子擴散模型中。然后使用光學特性的數據來改進基于模型的數據分析。根據DTOF，我們還計算了活羊的DPF，因此為該參數提供了全新的數據（見補充表ST1）。就我們目前所知，文獻中僅引用了從單個動物獲得的死后DPF數據36。由于動物生產科學中的遺傳選擇和繁殖程序，動物與動物之間的高度一致性，我們的DPF數據有助于提高對綿羊進行的其他fNIRS研究的分析21的準確性37，38。
最后，為了改進大腦皮層血流動力學反應的估計，我們引入了一種基于模型的方法，對來自短距離和長距離的fNIRS信號進行數據分析，并通過模擬進行了驗證（如補充章節S4所述）。該模型采用了兩層幾何結構，以更好地模擬綿羊頭部的腦外和腦內組織層，旨在推進之前的方法 |
